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Bakterielle Infektionen sind eine sehr häufige Ursache lebensbedrohlicher Krankheitsbilder. Im betroffenen Organismus ruft der Kontakt von Zellen mit Bakterien zunächst eine lokale Immunreaktion hervor, deren Ziel es ist, das Eindringen der Bakterien zu hemmen und Phagozytose zu induzieren. Daher produzieren Bakterien eine große Anzahl an Virulenzfaktoren, die einerseits diese Abwehrreaktionen der Wirtszelle blockieren sollen, andererseits aber auch die infizierte Wirtszelle in einem für das Bakterium positive Sinne (Replikation, Ausbreitung) manipulieren (z.B. durch Zytoskelettveränderungen). Die zellbiologische und molekulare Aufklärung der vielfältigen Wirkungen bakterieller Virulenzfaktoren eröffnet deshalb nicht nur faszinierende Einblicke in Mechanismen der Signaltransduktion und Immunreaktion, sondert erschließt auch neue, von den klassischen Antibiotika differierende Angriffs-punkte für antibakterielle Therapien, nicht nur auf der Erreger-, sondern auch auf der Wirtszellseite (Bhavsar et al., 2007) .
Das ist insbesondere wichtig, da trotz steigender Anzahl von Erregern, die gegen fast alle zugelassenen Antibiotika resistent sind, in den letzten vierzig Jahren nur sehr wenige konzeptionell neue Antibiotika entwickelt worden sind (Streptogamine: Quinupristin/Dalfopristin , Oxazolidinone: Linezolid, zyklische Lipopeptide: Daptomycin) (Walsh, 2003) . Unter den bakteriellen Virulenzfaktoren bilden die Poren-formenden Toxine (PFT) die größte Klasse. Bekannte Vertreter sind z.B. Listeriolysin O (LLO) aus Listeria monocytogenes, Streptolysin O aus Streptococcus pyogenes oder Pneumolysin O aus Streptococcus pneumoniae, die zur Gruppe der CDTx-Toxine ( Cholesterol dependent to xins) gehören oder auch Alpha-Hämolysin (HlyA) aus E.Coli aus der Gruppe der RTx-Toxine ( repeats in to xin). PFT werden von Bakterien in wasserlöslicher Form sezerniert und multimerisieren in der Plasmamembran der Wirtszelle zu amphipathischen Strukturen, die eine Ionen- und je nach Größe der Pore auch proteindurchlässige Pore bilden (Gonzalez et al., 2007) . Hierdurch kommt es zum K+-Ausstrom sowie Na+- und Ca2+-Einstrom, sowie bei hohen PFT Konzentrationen zur Lyse der Zellen. So ermöglicht z. B. LLO durch lytische Porenbildung bei hohen Konzentrationen auch die Evasion von Listerien aus dem Phagolysosom in das Zytosol der Wirtszelle. Porenbildende Toxine rufen aber auch schon in geringeren, sublytischen Konzentrationen eine Reihe weiterer konzentrations-, zelltyp-, und expositionszeitabhängiger unterschiedlicher Wirtszellantworten hervor, deren Aufklärung auf molekularer Ebene in den letzten Jahren große Fortschritte gemacht hat. So können sublytische Konzentrationen offensichtlich zur Induktion apoptotischer Signalwege (Guzman et al., 1996; Carrero et al., 2004) und zur Auslösung inflammatorischer Reaktionen führen. Beschrieben sind die Aktivierung der MAP Kinasen p38 und ERK (Tang et al., 1994; Tang et al., 1996; Tang et al., 1998) , des NF-kB Signalweges (Kayal et al., 2002), die Induktion von Zytokin-/Chemokingenen (Kayal et al., 1999; Kayal et al., 2002; Opitz et al., 2006) und die Induktion von Plasmamembran-reparaturmechanismen (Gurcel et al., 2006) . PFT aktivieren das Inflammasom und nachfolgend Caspase 1, wodurch SREBP ( Sterol- Regulatory Element Binding Protein) Transkriptionsfaktoren aktiviert werden, die die (Chole)sterolsynthese induzieren können und durch verstärkte Membranneusynthese die Überlebensfähigkeit der Zellen verbessern (Gurcel et al., 2006). Neueste Arbeiten zeigen auch, dass LLO über posttranslationale Modifikationen (De-Aceytylierung, De-Phosphorylierung) an freien Histonenden (den sogenannten „Histone Tails“) die Induktion oder Repression von Wirtszellgenen induziert (Hamon et al., 2007). Dieser Mechanismus scheint allerdings unabhängig von den porenbildenden Eigenschaften zu sein (Iacovache et al., 2006; Aroian and van der Goot, 2007) . In C.elegans konnte zum ersten Mal eine protektive Rolle von SEK-1 (entspricht MKK4, einer „Upstream“ Kinase von p38 und JNK) beim PFT-induzierten Wirtszelltod nachgewiesen werden (Huffman et al., 2004). Dieser Befund wurde für den p38-Signalweg durch Versuche mit einem Blocker für diese Kinase (SB 203580) auf Säugerzellen ausgeweitet (Huffman et al., 2004) . Erste orientierende Untersuchungen mit siRNA Bibliotheken in Listerien-infizierten Drososphila- oder Säugerzellen zeigen eine sehr komplexe Antwort auf Infektion mit L.monocytogenes. Da LLO für die Virulenz von L.monocytogenes sehr wichtig ist, kann aus diesen Ergebnissen abgeleitet werden, dass auch die isolierte Behandlung von Zellen mit LLO sehr komplexe Zellantworten hervorruft (Cheng and Portnoy, 2003; Agaisse et al., 2005; Cheng et al., 2005) . Zusammenfassend können viele der bisher gefundenen Wirtszellantworten als eine Art zelluläre „non-immune defense reaction“ aufgefasst werden, sind also Teil einer uralten unspezifischen Abwehrreaktion auf PFT (Aroian et al., 2007).
Obwohl sich eine Reihe von Veröffentlichungen mit der Induktion verschiedenster intrazellulärer Signalwege beschäftigen, fällt auf, dass die Art der Kopplung zwischen PFT und den induzierten Signalwegen bislang meist ungeklärt bleibt. Diskutiert wird, dass PFT-induzierte transiente intrazelluläre Ca 2+-Konzentrationserhöhungen, häufig auch als Ca2+-Oszillationen bezeichnet, selektiv Signalwege oder auch Genexpression induzieren könnten. Auch ist unklar, wie Zellen diese Ca2+-Oszillationen auf molekularer Ebene interpretieren und in eine spezifische Antworten umsetzen. Bislang gibt es hierzu nur Analogieschlüsse aus Ergebnissen, die nicht an PFT-induzierten Systemen gewonnen wurden (Negulescu et al., 1994; Dolmetsch et al., 1997; Berridge et al., 1998; Gordo et al., 2002), oder es werden Signalwege über membranständige Rezeptoren postuliert (Uhlen et al.,2000). Tatsächlich ist aber der eindeutige Nachweis einer direkten Kopplung zwischen Porenaktivität, daraus resultierenden intrazellulären Ca2+-Oszillationen und der möglicherweise frequenzabhängigen differentiellen Aktivierung spezifischer intra-zellulärer Signalwege bis hin zu veränderter Genexpression noch nicht geführt. Wir haben uns zum Ziel gesetzt, diesen Nachweis mit Hilfe einer Kombination aus Elektrophysiologie, Zellbiologie, und Life-Cell Imaging –Techniken zum einen und molekularbiologischen und biochemischen Ansätzen zum anderen zu führen. Dazu wurden in den letzten 5 Jahren die grundlegenden Arbeitstechniken für die Analyse bakterieller und viraler porenbildender Proteine bzw. Peptidtoxine erarbeitet. Erwähnenswert ist hier der erstmalige direkte Nachweis der säureinduzierten transienten Porenbildung durch virale Klasse-II Fusionsproteine (Koschinski et al., 2003; Wengler et al., 2003; Wengler et al., 2004; Koschinski et al., 2005; Wengler et al., 2007). Parallel dazu wurden die Effekte cholesterolabhängiger sowie nicht-cholesterol-abhängiger bakterieller, porenbildender Peptidtoxine an Membranen lebender Zellen untersucht (CDTx- und RTx-Familie). Ebenso wie für die viralen Proteine konnte diese toxininduzierte Porenbildung in sublytischen Konzentrationen hier ebenfalls zum Teil erstmalig an Membranen lebender Zellen nachgewiesen werden. Neben der elektrophysiologischen Charakterisierung von durch LLO bzw. HlyA induzierten Poren konnten auch wichtige Folgeprozesse und ihre kausale Verknüpfung mit der Porenbildung nachgewiesen werden. So konnte mittels Ca2+-Imaging bzw. der simultanen Verwendung von Ca2+-Imaging und Patch-Clamp-Technik eindeutig gezeigt werden, dass z.B. LLO oder HlyA-Poren direkt und ohne die Beteiligung weiterer Komponenten wie Ca 2+-Kanäle oder rezeptorvermittelter intrazellulärer Ca2+-freisetzung eine transiente und repetitive intrazelluläre Ca2+-Konzentrationserhöhung induzieren können (Repp et al., 2002; Koschinski et al, 2006).
Wir haben nun zelluläre Modellsysteme etabliert, bei denen in Echtzeit die PFT-induzierte Porenbildung mittels Patch-Clamp-Technik und die dabei auftretenden Änderungen der intrazellulären Ca2+-Konzentration auf Einzellzellebene verfolgt werden können. Hierbei zeigte sich, dass niedrige sublytische Konzentrationen von LLO in allen untersuchten Zelltypen zur Bildung transienter Membranporen führt, durch die unter anderem Ca2+ in die Zelle einströmt. Die direkte Kopplung zwischen sich statistisch bildender Pore und intrazellulärer Ca2+-Konzentrationserhöhung konnte durch simultane Patch-Clamp und Ca2+-Imaging Versuche gezeigt werden. Die Möglichkeit, mit Hilfe von rekombinanten PFT kontrolliert unterschiedliche Ca2+-Signale in Zellen zu induzieren wird von uns genutzt, um zu untersuchen, wie Zellen diese Ca2+-Signale intrazellulär verarbeiten und welche molekularen Mechanismen PFT-induzierte transiente oder auch länger persistierende Ca2+-Oszillationen an Signalkaskaden ankoppeln. Dazu verifizieren wir Prozesse wie Apoptose, Membranreparatur oder auch Signalwege, die im Kontext von Proliferation, Stress- oder Entzündungsgeschehen stehen auf ihre Aktivierung durch PFT hin und identifizieren beteiligte Signalmoleküle. Diese Signalmoleküle dienen uns gleichzeitig als „Read-Out“ zur Suche nach den Zwischenschritten, also der Kopplung zwischen Ca2+-Signal und aktivierten intrazellulären Signalwegen, sowie einer möglicherweise von der Ca2+-Oszillationsfrequenz abhängigen differentiellen Signalwegsaktivierung. Im Unterschied zu vielen anderen rein biochemisch-molekularbiologisch ausgerichteten Arbeitsgruppen haben wir dabei die Möglichkeit, jedes dazu notwendige Setup mit Hilfe der Patch-Clamp Technik sowie der verschiedenen Imaging-Techniken auf Porenbildung bzw Ca2+-Oszillationen sozusagen „Online“ zu kontrollieren. PFT-induzierte Signalwege sollen dann bis hin zu veränderter Genexpression als zelluläre Antwort auf den Virulenzfaktor PFT verfolgt, und Zielgene identifiziert werden. Dabei werden auch PFT-induzierte Histonveränderungen („Rearrangements“) als weitere Regulationsebene bzw. als mögliches „zelluläres Gedächtnis“ in die Untersuchungen mit einbezogen.
Abbildung 1 zeigt ein hypothetisches, vereinfachtes Modell dieser durch PFT ausgelösten Signaltransduktionsvorgänge.
Abb. 1:
Hypothetisches, vereinfachtes Modell der durch PFT ausgelösten Signaltransduktionsvorgänge. Porenbildung an der Plasmamembran führt zur (oszillierenden) Erhöhung des intrazellulären Ca2+-Spiegels. Hierdurch werden eine Reihe von Proteinkinasen aktivert, die durch Histonmodifikationen und Phosphorylierung von Transkriptionsfaktoren (z.B. CREB) eine Reihe von Zielgenen innerhalb von 30 min. bis wenigen Stunden aktivieren. Diese Zielgene bestimmen die möglichen Reaktionen der Wirtszelle. Daneben führen PFT auch zu einer Aktivierung apoptotischer Signalwege, deren „Up“- und „Downstream“ Mechanismen ebenfalls zum Teil noch ungeklärt sind. Trotz der Fortschritte bei der Aufklärung der Induktion intrazellulärer Signalwege durch PFT zeigen die Fragezeichen, dass viele Zusammenhänge bislang noch unklar oder nur postuliert sind. Insbesondere die Ankopplung der PFT-induzierten Signale an intrazelluläre Signalkaskaden, aber auch weiterführende zelluläre Vorgänge / Moleküle werden von unserer Arbeitsgruppe untersucht.
Abkürzungen: ATF1: activating transcription factor 1; CREB: cAMP response element binding protein ; ER: endoplasmatisches Reticulum; ERK: extracellular-regulated Kinase; JNK: c-Jun N-terminale Kinase (synonym: SAPK: stress-activated protein kinase); MAP-Kinase: mitogen-aktivated protein Kinase; MKK: MAP-Kinase-Kinase; MEK: mitogen-extracellular-regulated protein Kinase; MK2: mitogen-activated protein kinase-activated protein Kinase 2 (synonym: MAPKAP-K2); MSK: mitogen- and stress-activated Kinase; NF-kappaB: nuclear factor kappa B; Ras/Raf: zentrale Signalmoleküle des Rezeptor-Tyrosinkinase-Signalwegs. CREB, NF-kappaB, c-Fos, c-Jun, Elk-1, ATF1 und Egr1 sind Transkriptionsfakoren.
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